单细胞测序技术，既往从未有过接触，也没有自学资料的整理，今天以单细胞测学技术在非小细胞肺癌领域的应用探索综述进行知识盲区的扫盲。
——单细胞测序技术——
单细胞测序是从单个细胞水平对基因组和转录组进行研究。年以来，10XGenomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技术的出现，彻底降低了单细胞测序的成本门槛。自此，单细胞测序技术被广泛应用于基础科研和临床研究。通过单细胞测序可以最大程度的反映细胞的异质性，发现新的细胞群和细胞亚群，并为阐明细胞状态转换的调控机理提供了技术保障。单细胞技术以及数据分析方法在肿瘤、发育生物学、免疫学、神经科学等领域有重要应用，是现今生命科学研究的热点。
首先需要明确的一点：单细胞测序首先不是仅仅对一个细胞进行测序，而是说该项技术能对单一细胞的基因组或转录组进行测序，可以理解为单细胞水平上的测序。本文主要探索单细胞测序技术在肿瘤领域的应用，因此，主要聚焦肿瘤相关的技术研发进展。
肿瘤相关细胞异质性测序困境
比如，在肿瘤组织中，肿块中心的细胞与肿块周围的细胞，原发灶与转移灶的细胞，其基因组与转录组等遗传信息是存在差异的，这也就导致不同肿瘤细胞表现出免疫特性、生长速度、侵袭能力等表型方面的差异，最终导致对不同抗肿瘤药物的敏感性不同或放疗敏感性的差异。
传统测序方法所展示的信息是在多细胞水平上的平均信息，异质性信息容易被忽略掉，而单细胞水平上的测序则完全可以反应同一个细胞群里不同细胞的基因组和转录组状况。单细胞测序技术的出现，使得从混杂的样品中筛选出异质性信息的难题得以解决。
单细胞测序技术以单个细胞作为对象，通过对单个细胞遗传物质均匀扩增，标记建库后进行测序，最后对单个细胞基因组或转录组展开数据分析，其技术原理主要包括单细胞分离、扩增测序和数据分析3方面。最为核心的，或者我认为大家需要记住的流程，主要是：分离单细胞（核），将RNA转换为cDNA，准备测序文库（illumina）后测序。
这里就用到我之前整理的幻灯（药物研发基本原理（第二章）(下)）也是本文持续回顾基础，同时追踪前沿进展两步走的重要原因所在。离开了基础太远的设想，都是无根之萍。
对于具体的单细胞测序技术不同类型的比较和详细的流程，不在此次介绍范畴，也超脱了目前的能力范畴。以上知识点能掌握即可。
——NSCLC的单细胞测序技术综述——
摘要
非小细胞肺癌（NSCLC）的一线免疫治疗大大提高了患者的生存率。在免疫检查点抑制剂应用之前，患者需要进行PD-L1检测。然而，PD-L1生物标志物无法准确预测患者的免疫治疗反应。另一方面，免疫疗法所导致的免疫相关毒性机制尚不清楚。因此，开发临床认可的预测性生物标志物以更好地选择免疫治疗获益型患者并改善风险管理的需求，是目前临床尚未满足的需求。单细胞技术为肿瘤及其微环境提供了前所未有的洞察力，从而发现了参与免疫检查点抑制剂反应或毒性的免疫细胞。在这篇综述中，研究团队将强调单细胞方法识别候选生物标志物以改善NSCLC患者治疗的潜力。
晚期非小细胞肺癌（NSCLC）中的生物标记物鉴定
PD-L1免疫组化用于测定PD-L1表达肿瘤细胞的比例,探寻免疫治疗效果与PD-L1免疫组化的相关性，是第一个发表的ICI治疗相关的生物标志物。多个前瞻性试验表明，组织PD-L1表达水平与临床疗效之间存在相关性，特别是KEYNOTE-，KEYNOTE和PACIFIC研究。
不同的ICI采用不同的PD-L1检测技术平台：帕博利珠单抗为22C3，纳武利尤单抗为28–8，另外，纳武利尤单抗为SP，阿替利珠单抗为SP。22C3、28–8和SP测定结果相似，但SP灵敏度降低。
然而，IHC染色（肿瘤细胞、免疫细胞或两者）的最佳选择和PD-L1染色阳性的cut-off值仍在争论中。此外，一些研究表明PD-L1表达不能预测ICI治疗的临床效果，一些患者的PD-L1表达1%却具有显著的应答率。由于这些原因，PD-L1表达被认为是不完美的生物标志物。
表1.使用单细胞技术鉴定NSCLC免疫治疗预测性生物标志物的综述
Datar等人对20例原发性切除NSCLC的浸润白细胞进行表型分析，以评估三个免疫检查点PD-1、LAG-3和TIM-3表达的生物学意义。通过包含35个标记的panel能够监测9种不同的免疫人群：CD8+T细胞、CD4+T细胞、调节性T细胞（Tregs）、自然杀伤（NK）细胞、NKT细胞、B细胞、粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。
PD-1主要表达于CD8+T细胞，CD25?FOXP3?CD4+T辅助细胞，CD3+CD56+NKT细胞；
TIM-3在巨噬细胞中广泛表达，NK和NKT细胞表达最高；
关于它们的共表达比例，5.4%的CD3+TIL对三种标记物呈阳性，9.1%为PD-1+LAG-3+，21%为PD-1+TIM-3+，10.3%为LAG-3+TIM-3+。有意思的是，PD-1和TIM-3的共表达有利于耗尽T细胞的持续存在。
由于该panel包含提示细胞功能的标记，研究者研究了表达上述免疫检查点的T细胞的功能特征。并评估了三个免疫检查点对90名接受PD-1抑制剂治疗的患者生存率的影响。
PD-1+LAG-3+TIM-3+T细胞的活化标志物CD69和4-1BB、细胞毒性标志物颗粒酶GZMB、增殖标志物Ki67、凋亡受体FAS和促凋亡蛋白BIM的表达最高。
最后，他们评估了三个免疫检查点对90名接受PD-1抑制剂治疗的患者生存率的影响。
PD-1和TIM-3T细胞的高表达都不能预测PFS的改善；
然而，LAG-3表达高的患者表现出明显较差的预后，而LAG-3低表达和PD-L1高表达的患者具有改善的PFS；
这些结果表明，LAG-3可能是免疫疗法耐药性的重要靶点，并可作为改善ICI反应的靶点。
延申阅读：
年3月19日，百时美施贵宝（BristolMyersSquibb,BMS）宣布其First-in-class双免疫疗法Relatlimab+Nivolumab固定剂量组合Opdualag获FDA加速批准上市，治疗转移性黑色素瘤。Relatlimab是一款靶向淋巴细胞活化基因3（LAG3，CD）的单抗药物）；
年10月5日，Immutep公司宣布，美国FDA已授予其潜在“first-in-class”可溶性LAG-3融合蛋白eftilagimodalpha（efti，又名IMP）快速通道资格，与抗PD-1抗体Keytruda联用，一线治疗非小细胞肺癌（NSCLC）。
irAE
ICI的临床益处受到irAE的限制。约10%的NSCLC患者在免疫治疗过程中会发生3级及以上irAE，导致ICI暂停或永久停用。
与单独使用PD-1/PD-L1抑制剂相比，化疗联合PD-1/PD-L2抑制剂与较低的严重irAE风险相关，CTLA-4抑制剂的加入，增加了患者3级及以上irAE的发生率。
尽管irAE的发展与PD-1/PD-L1抑制剂的疗效改善相关，ICI相关的肺炎和任何级别的心肌炎都与NSCLC患者的生存率降低有关。
IrAEs治疗主要依赖皮质类固醇，根据严重程度从低剂量到高剂量。
一项对名接受ICI治疗的肺癌患者进行的研究表明，在2%的严重irAE患者中，43%的患者出现了抗类固醇的irAE。
因此，这些高度异质性毒性的病理生理学需要进一步研究，以指导患者的风险分层和管理策略，并扩大ICI的临床益处。
表2.使用单细胞技术研究ICI诱导的非小细胞肺癌irAE的综述
尽管ICI相关irAE的病理生理学与新发自身免疫性疾病相似，但其确切的潜在机制尚未完全阐明。近年来，采用单细胞测序技术用来探寻相关标记物与irAE发生机制和几率关系的研究逐渐增多。
对于单细胞测序技术的基础研究，不是本文的重点，对于资本过度介入的领域，特别是新兴行业，一直保持谨慎的态度。也为了防止造成临床指导用药的误导，对于具体的偏重基础研究的内容不再翻译。上述疗效中有关LAG3的延伸阅读，也是基于真实世界中已经获得验证的实例进行佐证。本文重点还是就单细胞测序技术进行自我知识盲区的扫盲工作，仅此而已。
参考文献
WlosikJ,FattoriS,RochigneuxP,GoncalvesA,OliveD,ChretienAS.ImmunebiologyofNSCLCrevealedbysingle-celltechnologies:implicationsforthedevelopmentofbiomarkersinpatientstreatedwithimmunotherapy.SeminImmunopathol.Nov21.doi:10./s---1.Epubaheadofprint.PMID:.
